Western blot/CCK8/MTT/Transwell細(xì)胞遷移

背景：
蛋白質(zhì)印跡的發(fā)明者是斯坦福大學(xué)George Stark。Neal Burnette于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中*被稱為Western Blot。開始做印跡的是一個(gè)叫Southern的科學(xué)家，但印跡的對(duì)象是DNA鏈，他把這種技術(shù)稱為Southern blot，后來出現(xiàn)了兩個(gè)過程相似，但是對(duì)象不同的印跡方法，一個(gè)針對(duì)RNA，一個(gè)對(duì)蛋白質(zhì)，人們分別把這兩種技術(shù)的稱為Northern和 Western，與這兩個(gè)技術(shù)的發(fā)明人沒有關(guān)系了。

一、蛋白質(zhì)的樣品制備：
由于這一步方法各異，具體步驟請(qǐng)參考試劑盒的說明書即可。蛋白質(zhì)的樣品制備是Western Blotting的*步，樣品制備是關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下問題：
       > 在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的大溶解性和可重復(fù)性。
       > 選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià)鍵二硫鍵，使其形成一個(gè)各自多肽的溶液。盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。
       > 防止蛋白質(zhì)在樣品處理過程中的人為的修飾，制備過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（加入合適的蛋白酶抑制劑）。
       > 樣品建議分裝成合適的量（比如分裝出20ul檢測(cè)蛋白質(zhì)定量用），然后保存與-20°或-80℃中長(zhǎng)期保存，但要注意不要反復(fù)凍融，因?yàn)闀?huì)使蛋白的抗原特性發(fā)生改變。
       > 若蛋白提取過程存在問題或蛋白發(fā)生降解則很難進(jìn)行好之后的實(shí)驗(yàn)，也就很難做出好的結(jié)果了。除此之外 loading buffer的作用也不容忽視，切莫使用不新鮮的上樣緩沖液，同時(shí)在處理時(shí)也應(yīng)注意將樣品與loading buffer混合均勻。
Western Blot
二、蛋白質(zhì)定量：
如果要定量的話，一般選擇BCA或者Bradford方法，BCA要求檢測(cè)波長(zhǎng)為562nm，Bradford為595nm。具體方法見各試劑盒說明 書。為避免假陽性結(jié)果，建議先把lysis buffer加入BCA工作液或考馬G250混合看是否產(chǎn)生顏色。測(cè)完蛋白含量后，計(jì)算含50~100ug蛋白的溶液體積即為上樣量（一般8cm寬的迷你 膠每個(gè)泳道大能承載的蛋白質(zhì)量為150ug，所以如果從組織提取蛋白的話上樣量不宜過大）。網(wǎng)上有人喜歡等質(zhì)量上樣（即每個(gè)泳道的上樣體積不一但質(zhì)量一 定），也有使用等體積上樣（即先把各個(gè)樣品稀釋到某一固定濃度，然后等體積等質(zhì)量上樣，計(jì)算上樣體積時(shí)需包含loading buffer的體積）。按分子克隆的說法，還是使用等體積上樣比較好。上樣總體積一般不超過15ul，加樣孔的大限度可加20ul樣品。上樣前要將樣品 置于燒杯內(nèi)，將燒杯置于石棉網(wǎng)上用酒精燈加熱至沸騰，在沸水中煮3~5min使蛋白充分變性。也可以使用PCR儀95°加熱5min，效果佳，操作方便。 之后樣品可以在4℃冰箱短時(shí)間保存，也可在-20°冰箱保存數(shù)月，但是反復(fù)凍融會(huì)使蛋白質(zhì)的抗原特性改變。

三、SDS－PAGE電泳
       1、清洗玻璃板：
蘸點(diǎn)洗潔精輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。若不繼續(xù)使用，需用無水乙醇擦拭后晾干再妥善收起來，玻璃板之間墊玻璃紙隔開。梳子應(yīng)用水洗干凈，臨用前用無水乙醇擦拭晾干。
       2、灌膠與上樣
① 玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠（操作前先往玻璃板間灌水，檢查是否漏）。
② 按配膠試劑盒說明書選擇合適的分離膠濃度配置，后加入TEMED，之后搖勻即可灌膠。配制凝膠時(shí)要充分混勻，此外應(yīng)保證試劑的新鮮，特別是過硫 酸銨。灌膠時(shí)掌握好速度，避免氣泡產(chǎn)生（注意濃度越小的膠含水越多，凝固后膠體積縮小越多）。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快（灌膠時(shí)開始可快一 些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變形）。未聚合的丙烯酰胺具有神 經(jīng)毒性，操作時(shí)應(yīng)該戴手套防護(hù)。梳子插入濃縮膠時(shí)，應(yīng)確保沒有氣泡。注意給積層膠留出足夠的空間（分子克隆推薦長(zhǎng)度為插入的梳齒長(zhǎng)再加1cm）。
③ 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了。再等幾分鐘覺得差不多的時(shí)候就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。聚合時(shí)間由AP以及TEMED決 定，通常在30min左右，AP不新鮮會(huì)導(dǎo)致聚合變慢，氣溫較低時(shí)膠是會(huì)凝得慢一些，必要時(shí)可適當(dāng)增加AP以及TEMED的量，但通常不會(huì)超過1h，若超 過1h甚至更長(zhǎng)仍未聚合，應(yīng)檢查配制的操作有無錯(cuò)誤。由于TEMED催化APS釋放相關(guān)化學(xué)基團(tuán)，再由APS釋放的基團(tuán)催化Acr/Bis聚合，所以如果 APS不新鮮的話加再多的TEMED效果也不佳，這就是為什么推薦APS每周新鮮配置的原因。
④ 按說明書配積層膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡 產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固前在兩邊補(bǔ)膠至剛剛冒頂。待到濃縮膠凝 固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。
⑤ 趁積層膠聚合的這段時(shí)間，取適當(dāng)體積樣本混合1X SDS loading buffer（事前分裝好，每次從冰箱里取一管即可），95~100°加熱5min，若有沉淀可用稍低溫度，比如45~55°加熱1h達(dá)到變性的目 的。我一般習(xí)慣分裝20ul到PCR管里，先和loading buffer混合好，臨用前用PCR儀加熱95°C 5min，效果不錯(cuò)。
⑥ 膠做好后連同玻璃板一起安裝到電泳槽上，加入電泳緩沖液后開始準(zhǔn)備上樣（我們使用的是大連競(jìng)邁科技公司的MV-III型小型單垂直板電泳槽，電泳 液至少要漫過內(nèi)測(cè)的小玻璃板，電泳槽下面不用倒太多電泳液）。加樣前可用5ml注射器或加樣器先沖洗一下加樣孔。用微量加樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不 要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖 液中洗滌3次，以免交叉污染。目前我們做的mini膠上有10個(gè)上樣孔，一般在*個(gè)孔加入marker（我用的是Fermentas預(yù)染 marker），其余9個(gè)孔加入樣品，也可在頭尾孔內(nèi)加入marker，中間8個(gè)孔加樣品。加樣前樣品應(yīng)先離心，尤其是長(zhǎng)時(shí)間放置的樣品。在未加樣的孔中 應(yīng)加入等量的樣品緩沖液。上樣時(shí)，小心不要使樣品溢出而污染相臨加樣孔。也可使用10ul的槍頭就行，比用微量加樣器快很多，用槍頭時(shí)注意不要插得太深， 容易把玻璃板撐開，樣品就落到膠和玻璃板之間的空隙了。

Western Blot
       3、 電泳
       電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液沖洗清除黏附在凝膠底部的氣和未聚合的丙烯酰胺，網(wǎng)上有資料建議低電壓短時(shí)間的預(yù)電泳，清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì)，疏通凝膠孔徑以保證電泳 過程中電泳的暢通，但是在《分子克隆》上卻反對(duì)這種做法，理由是會(huì)破壞緩沖系統(tǒng)pH的不連續(xù)性。請(qǐng)各位按照實(shí)際經(jīng)驗(yàn)來做即可。電泳時(shí)間和電壓說法各異。按 照各實(shí)驗(yàn)室的慣例或者電泳槽的使用說明來操作。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。為減少蛋白質(zhì)條帶的擴(kuò)散，上樣后應(yīng)盡快進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后也 應(yīng)直接或者轉(zhuǎn)印。

四、轉(zhuǎn)膜
以下以使用半干轉(zhuǎn)膜為例。對(duì)于轉(zhuǎn)印90kd以下的蛋白，轉(zhuǎn)膜液都不用加SDS，如果是蛋白分子量大的話可以加入0.037%的SDS。
1、 在電泳結(jié)束前20min開始準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜所需的東西。轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張的濾紙（長(zhǎng)一般為8.1~8.3cm，寬度根據(jù)裁的膠大小實(shí)際測(cè)量，但膠一般會(huì)縮水， 所以裁8cm就行）和1張PVDF膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴干凈手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。PVDF膜使用前用無水甲醇中浸泡1min~2min。目 的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。
2、將玻璃板撬開才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會(huì)兒玻璃板便開始松動(dòng)，直到撬去玻板（撬時(shí)一定要小心，玻板很脆弱，我 用的是冰箱里附帶的塑料除霜鏟，效果出奇的好）。除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去，要避免把分離膠刮破。也可取10ml注射器吸滿轉(zhuǎn)印緩沖液，往玻璃板 與凝膠之間注水，使液體的壓力將兩者自然分開。取出凝膠后應(yīng)注意分清上下，可以在右上角裁一個(gè)小角。之后有兩種方法供選擇，一是按照marker指示，把 含有自己感興趣的蛋白的膠裁下來，二是把整張膠轉(zhuǎn)膜，前一種方法更加節(jié)約材料，但操作稍微麻煩了一點(diǎn)。在加有轉(zhuǎn)移液的培養(yǎng)皿里放入裁好的膠、浸過甲醇的 PVDF膜和濾紙，平衡10min左右，也是為了除去濾紙和轉(zhuǎn)移膜中的氣泡以及膠上多余的SDS。
  3、帶上手套，平放轉(zhuǎn)移槽的底座，依次在石墨電極上疊放3張浸泡過緩沖液的濾紙、PVDF膜（此時(shí)可在PVDF右上角減去一個(gè)角，以辨明轉(zhuǎn)膜后的蛋白面 與非蛋白面）、剛剛完成電泳的凝膠和另外3張浸泡過緩沖液的濾紙。用槍頭或移液管在疊層的濾紙上滾動(dòng)，除去氣泡。注意每疊一層就要用玻璃棒或圓筒試管趕去 氣泡，因?yàn)橐粋€(gè)氣泡的厚度對(duì)于蛋白來說都是十萬八千里的。用干凈紗布將疊層上面和周圍的多余緩沖液吸干（這一步很重要，寧可太干也不能太濕，太干容易燒 胡，太濕的話多余的緩沖液會(huì)導(dǎo)致電流短路，大大降低轉(zhuǎn)移效率，如果同時(shí)轉(zhuǎn)好幾條膠的時(shí)候更要小心，有一個(gè)膠短路就會(huì)影響整體的轉(zhuǎn)移效率）。后將轉(zhuǎn)移槽的 上蓋扣上，接通電源開始轉(zhuǎn)膜。由于設(shè)備昂貴，*次操作應(yīng)向熟手請(qǐng)教，否則短路可能燒壞設(shè)備！轉(zhuǎn)完后立即清洗設(shè)備，特別是金屬上蓋，轉(zhuǎn)膜液特別容易在金屬 上蓋上形成結(jié)痂，影響設(shè)備的正常使用，我們實(shí)驗(yàn)室今年做western的同志因?yàn)楹雎赃@一點(diǎn)，轉(zhuǎn)膜儀燒壞了好幾次。
4、依據(jù)分子量大小電泳15~60min。如果初次轉(zhuǎn)膜，可以根據(jù)一般經(jīng)驗(yàn)，即多少kD的蛋白就轉(zhuǎn)多少分鐘，再根據(jù)結(jié)果調(diào)整時(shí)間。之后斷開電源，取出轉(zhuǎn)移膜進(jìn)行后繼實(shí)驗(yàn)。
5、為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，使用預(yù)染。傳統(tǒng)方法是將膜用1×麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖）。然后用 水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。實(shí)際上更常用且簡(jiǎn)便的方法是先將膜晾干，然后浸入20%的甲醇，待*浸濕后取出透光觀察即可看到蛋白條帶（此 方法僅僅適合PVDF膜）。將膜晾干備用。使用預(yù)染marker話可以看見marker的顏色轉(zhuǎn)印到了膜上，但是憑借這個(gè)顏色來判斷是否轉(zhuǎn)印*或轉(zhuǎn)印過 頭是不可靠的。
Western blot/CCK8/MTT/Transwell細(xì)胞遷移
五、免疫雜交反應(yīng)
1、將膜移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1h即可。如果是自己配置的封閉液，過濾一下以消除固體雜質(zhì)。實(shí)際經(jīng)驗(yàn)表明與其封閉過夜，不如一抗孵育過夜。
2、將一抗用封閉液稀釋（一般用封閉液稀釋即可，如果背景不高用TBST稀釋也可以，當(dāng)然熟練后還可以自由發(fā)揮，配制一些自己的復(fù)方稀釋液）至適當(dāng)濃 度（可以在1.5mlEP管中配置工作液，常用稀釋倍數(shù)為1:200，1:500，1:1000，具體需要預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索，用后可回收重復(fù)用2~3次，但 回收重復(fù)利用的效果如何就要看抗體的質(zhì)量，分裝的抗體不推薦回收。稀釋后應(yīng)在2－3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復(fù)凍融。）；撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪 于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動(dòng)膜 四角以趕出殘留氣泡（也可使用手術(shù)室的病理袋，質(zhì)量不錯(cuò)，減去下面的折疊部分，用封口器（40~80元一個(gè)）封上，不漏液即可）。37°孵育1h之后轉(zhuǎn)移 到室溫下再孵育1h（或者4°孵育過夜），用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。也可以多洗幾次，比如4 次，每次5min。
3、在培養(yǎng)皿內(nèi)加入二抗稀釋液（10ml足夠了，一般1:1000甚至1:10000用TBST稀釋），放在搖床上，室溫下孵育1～2h后，用 TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。選擇好一個(gè)合適的條件不要輕易改變，另外相比一 抗，二抗作用的時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格控制，實(shí)踐證明一抗時(shí)間長(zhǎng)點(diǎn)可能沒什么關(guān)系，而二抗時(shí)間若過長(zhǎng)過短都將會(huì)直接影響結(jié)果。二抗孵育之后還要注意好好洗滌，否則顯影 是背景可能臟。

六、化學(xué)發(fā)光（ECL）
現(xiàn)在工作臺(tái)上鋪一張保鮮膜，將PVDF膜放在保鮮膜上。將ECL的A和B兩種試劑在EP管內(nèi)等體積混合（注意吸完A試劑后吸B試劑前要患槍頭），然后 均勻滴在PVDF膜的蛋白面，反應(yīng)1~2min后，將PVDF膜上多余的ECL工作液吸干，之后轉(zhuǎn)移到在X片夾中預(yù)先鋪好的保鮮膜上一側(cè)，把另一側(cè)翻過來 蓋在其上。用透明膠把保鮮膜固定在片夾上。

七、凝膠圖象分析
        將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值，比如bio-rad的Quantity One。

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